Western Blot原理及流程(2)
日期:2021-02-17 点击数:
1、制胶:浓缩胶/上层(5%);分离胶/下层(根据蛋白分子大小而定)(1)制胶前用纯水检漏,加入纯水放置2-3min;(2)配制下层胶:试剂盒配置好的胶液靠边注入玻璃板(尽量不要产生气泡);加入无水乙醇/双蒸水压平胶面,静置等胶凝固(根据天气室温变化,一般30min以上);配制上层胶:下层胶凝固后倒掉无水乙醇/双蒸水,滤纸吸干,上层胶缓缓注入,插梳子,等待凝固(约1h)1、配制上样体系:蛋白溶液+5×loading buffer+PBS2、上样:最左和最右孔可加SDS-PAGE loading buffer压平条带;可与最中央或左右两端各加入3-5ul的蛋白maker;蛋白样品上样(9ul)3、将胶置于电泳槽中,倒入电泳缓冲液,内部要漫过矮板,外部要漫过玻璃板底部;4、准备样品 maker 于冰盒上,顺序排好,上样,并在实验本上记录好;5、盖上电源盖,正负极相互对应,接通电源,恒压浓缩胶80V,30min或maker分离后可更改电压为120v,跑分离胶。待 loading buffer中的溴酚蓝跑至脚底部 1cm 处停止电泳。整个时间大概为 1.5h-2h。