Methods to Discover and Validate Biofluid-Based Biomarkers in Neurodegenerative Dementias

Molecular & cellular proteomics : MCP (IF:7)

2023年08月07日

简述

神经退行性痴呆症是一种进行性疾病，会导致不同大脑区域的神经元网络崩溃，这通常是由于错误折叠的蛋白质在脑细胞外基质（例如淀粉样蛋白）或神经元或大脑的其他细胞类型中积累所致。异常蛋白质堆积可能会直接损害蛋白质稳态和神经元的功能。它们还可能引起星形胶质细胞和小胶质细胞的活化，这种活化既可能是有益的，例如清除蛋白质堆积和恢复大脑活力的保护性反应，也可能是有害的，例如可能引起炎症、氧化应激和能量危机的过度活化，从而对大脑造成影响。当恢复能力和网络冗余及补偿机制耗尽时，突触功能障碍和神经元网络崩溃最终会导致临床症状和痴呆症；患者临床表型的确切性质取决于哪些大脑区域受到影响。

阿尔茨海默病（AD）的相关病理变化，主要包括细胞外淀粉样蛋白β（Aβ）斑块、神经元内tau蛋白缠结和神经退行性变，病理变化在症状出现前数年积累的症状前阶段是大多数神经退行性痴呆症的共同特征。虽然针对这些AD病理变化的可靠脑脊液（CSF）、血液和影像学生物标志物已经问世了一段时间，而且针对α-突触核蛋白病理变化的CSF生物标志物数据也很有希望，但仍然缺乏针对TAR DNA结合蛋白（TDP-43）包涵体的可靠生物标志物，而TDP-43包涵体是某些形式的额颞叶痴呆症（FTD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）的常见病理变化，也可见于AD和其他神经退行性痴呆症，而其他神经退行性病变可能涉及神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞功能障碍、血脑屏障功能障碍、髓鞘降解等特定方面，以及一系列其他可能与疾病相关的过程。

显然，神经退行性痴呆症需要亚洲通基于生物流体的生物标志物，以实现诊断和治疗的精准医学方法，亚洲通地了解潜在的疾病过程，并促进临床试验中患者纳入和评估工具的开发。在药物发现项目的早期阶段，资助方和监管机构都鼓励研究人员开发与药物靶点和药物潜在作用机制相关的可转化生物标志物流程。

Fig.?1 Comparison of mass spectrometry assays versus immunoassay

结合使用靶向和非靶向质谱（MS）方法是发现和验证生物标志物的有力工具。非靶向方法与生物信息学工作流程相结合，可以无偏倚地识别特定于疾病状态的蛋白质谱。候选生物标记物可以被识别并提交给特定的靶向MS工作流程。有针对性的工作流程可提高特异性和灵敏度。

无标记质谱（LF-MS）工作流程可用于生物标志物的发现，通过筛选样本来选择合适的候选肽。可以评估包含大量样本和附加正交技术的验证样本集。验证可使用多反应监测质谱（MRM-MS）或平行反应监测质谱（PRM-MS），其中低丰度蛋白可以以可重现的方式检测和定量，灵敏度更高。

LF-MS研究表征了不同神经退行性疾病患者的生物液体和脑组织的蛋白质组，这些疾病包括AD、帕金森病（PD）、FTD、路易体痴呆（DLB）和ALS。这些研究检查了疾病状态特征明确的患者队列和匹配对照组的蛋白质表达谱，旨在找到每种神经退行性疾病的特异性生物标志物。蛋白质表达的变化可被绘制并与病理生理机制相关联。

MS本身就是对代谢物和药物等小分子进行常规靶向分析的首选技术。MRM和PRM方法都可用于选择性定量神经退行性疾病中的生物标志物，而且对于现有临床检测的标准化也很有价值。例如，MRM-MS被用于CSF中Aβ42的测量标准化和认证参考物质的开发。此外，由于下文所述的一些局限性，非靶向LF-MS仍难以应用于临床环境，主要适用于发现环境。

MS区分蛋白质同源异构体和翻译后修饰的蛋白质的能力，加上具有高多重检测能力，可显著增加从患者样本中获得的生物信息量。MS方法不依赖抗体，这对于没有或很难产生商业抗体的目标蛋白质来说是一个优势。此外，高特异性也是MS在生物标志物筛选、临床验证和检测标准化方面的一个有吸引力的特点。

LF-MS的主要优点是实验设置简单，无需标记和后续复杂的实验设计。

使用定量MS进行蛋白质定量的一个缺点是需要对酶消化蛋白质，通常使用胰蛋白酶，胰蛋白酶会切割赖氨酸或精氨酸两侧的肽，从而限制了蛋白质中可测量的肽的数量。此外，其中一些肽可能不适合LC-MS。

LF-MS的主要局限之一是重现性差，尤其是使用数据依赖采集（DDA）方法时。

MS的其他局限性与MS技术的复杂性有关。要获得可靠的结果，需要训练有素的人员，以及只有在专业实验室才能获得的专用设备和仪器。

未来，LF-MS将继续在神经系统疾病的生物标志物发现和临床应用中发挥作用，这要归功于技术进步和更快、更灵敏的MS仪器的出现。如今，对大量患者（>1000）进行分析已成为可能，从而最大限度地缩短了样本周转时间，并能在血浆等具有挑战性的生物液体中获得高质量的数据。此外，由于淀粉样蛋白或突触核蛋白等蛋白质的修饰与致病过程密切相关，鉴定和定量翻译后修饰的蛋白质和多肽可能有助于发现神经退行性疾病的特定PTM特征。

一些出版物显示，对于淀粉样蛋白和tau蛋白等AD关键血液生物标志物，定量靶向MS方法优于免疫检测。因此，将这些方法应用于临床是一个很有吸引力的前景，但需要技术和成本的重大发展才能与常规应用相匹配。利用MS的多重能力定量一组生物标志物的前景也非常有趣。可以想象将涉及神经退行性变、神经炎症、突触功能和并发病症等不同方面的生物标记物结合起来。这样就有可能建立起结合这些标志物的高效可靠的算法。

基于抗体的检测方法

1. 基于邻近延伸分析的蛋白质组学

在神经退行性痴呆症中，邻近延伸分析（PEA）技术已被用于鉴定新的血浆和CSF生物标志物，例如，用于鉴别诊断和预测痴呆症的转化。为了表征疾病生物学，多项研究重点分析了各种疾病机制，例如炎症。总之，这些应用还可以帮助寻找神经退行性疾病的新药物靶点。

迄今为止，PEA技术尚未应用于临床。该平台主要用于探索和疾病建模。这可能是由于测量的只是相对蛋白质浓度，无法确定特定蛋白质的临界值（目前一些PEA方法正在根据蛋白质标准品进行校准，因此这种情况可能很快就会改变）。

其优点是，通过多重检测，可在一个样本中同时测量数千种蛋白质，而所需总体积仅为3 μl。由于需要两个匹配的抗体-DNA对和用于dsDNA扩增的蛋白质特异性引物，在多重过程中经常观察到的交叉反应效应被最小化。

使用PCR扩增dsDNA序列可以检测极低浓度的蛋白质，从而提高灵敏度。通过使用基于抗体的方法发现生物标志物，克服了与单一免疫测定的技术转化差距。借助Olink蛋白质组学发现生物标志物，在发现组合中应用的相同抗体对可用于进一步的单一生物标志物检测开发。

生物富集分析的一个局限性是蛋白质选择偏向于具有良好抗体对的蛋白质，可能会高估具有良好抗体的蛋白质，而低估没有抗体或只有弱抗体的蛋白质。此外，大多数检测组合只提供蛋白质浓度的相对定量，无法在不使用桥接样本的情况下直接比较一次运行中的不同蛋白质的水平或运行之间相同蛋白质的水平。

新蛋白质的鉴定和高特异性抗体的开发将使PEA检测组合得到进一步扩展。此外，还可以针对特定疾病生成更小的定制检测组套，包括用于绝对定量的蛋白质标准品。随着使用PEA的研究越来越多，跨疾病荟萃分析将变得非常重要。为了对蛋白质组进行更深入的分析，研究已开始使用多平台蛋白质组学，将PEA、SomaScan和MS蛋白质组学结合起来。

2. 使用基于微珠的检测进行多重蛋白质分析

基于微珠的蛋白质谱分析广泛应用于各种研究领域。例如，使用内部开发的方法和市售试剂盒以多重方式分析了核心AD生物标志物的CSF水平。还有一些例子说明了如何使用预制的细胞因子检测组套用于PD的血清分析，以及如何使用预制的补体因子检测组套用于GENFI队列的血浆样本以寻找与FTD相关的特征。在一项研究中，根据对一套预制蛋白质检测组套的初步分析，组装了一个定制设计的检测组套，并在AD队列的血清样本中进行了评估。单一结合分析已被应用于对AD、FTD、ALS的CSF和血浆/血清进行大规模分析，并用于分析认知健康个体的CSF蛋白水平。这些研究报告了与疾病诊断以及患者亚组和临床特征的密切联系。

一些基于微珠的检测方法被用于临床实验室实践，例如临床免疫学，但总体而言，使用基于微珠的检测方法的多重分析方法主要局限于研究用途，尽管目前正在开发各种转化方法。

基于抗体的传统方法适用于特定蛋白质的靶向研究，但并不适合更广泛的探索性研究。基于微珠的多重免疫测定的主要优势在于靶向设置的能力，可实现高通量和多重蛋白质分析。优势还包括样本消耗量低；对于单一结合设置，只需15 μl CSF和3 μl血浆即可进行标记，标记量可用于分析多达六种不同的384蛋白检测。样本制备和工作流程通常都很简单，可以用标准实验室设备来完成，也可以用机器人处理和自动化来实现。由于使用了抗体，这些方法也可用于高复杂性的样本，同时仍能保持较高的灵敏度和特异性。检测限取决于所使用的特定试剂，但一般在低pg到低ng/ml之间。单重检测可以包含标准曲线，从而进行绝对定量估算，并将长期生成的数据集进行组合。蛋白质检测组套可针对每个研究问题和研究进行专门定义。还可以使用相同的试剂设置，将多重和探索性研究设置转换为更有针对性的验证研究。

多重检测就需要权衡以达到所含蛋白质的最佳分析条件。对于一个检测组套中的所有蛋白质，样本都要进行同样的处理，而对于每种试剂，条件可能不是最佳的。此外，在大规模研究中，不可能包括所有蛋白质的标准曲线。在商业检测中，成本是按整个检测组套计算的，因此，如果在只对少数几种蛋白质感兴趣的特定研究中，分析成本就会很高。

蛋白质是否被纳入检测组套取决于是否有合适的抗体。因此，内部制作更大的检测组套可能仅限于能够获得大量抗体的研究环境，例如人类蛋白质图谱（www.proteinatlas.org）。检测性能取决于抗体的特异性和选择性，在只使用一种抗体检测蛋白质的单一结合设置中，任何非特异性相互作用都会产生信号（在夹心形式中，使用针对同一蛋白质上不同表位的两种特异性抗体，信号会被抵消）。与所有免疫测定一样，结果需要在生物学和技术可重复性方面进行验证。

预计抗体的可用性将随着时间的推移而增加，从而进一步扩大现有的检测组套，并拓宽多重检测的应用范围。通过开发新的检测方法（例如光激化学发光），可以提高灵敏度和多重能力，并且使用蛋白质检测组套的临床应用可能会在未来几年出现。

3. 酶联免疫吸附实验

免疫测定，尤其是ELISA，在临床医学中对疾病的诊断和预后起着关键作用。在神经退行性疾病（例如AD）领域，通常使用ELISA对患者CSF中的低丰度蛋白质进行定量。使用ELISA技术常规定量的CSF生物标志物包括Aβ（Aβ40和Aβ42）、总tau蛋白和磷酸化tau蛋白、神经纤维丝轻链（NfL）和神经颗粒蛋白。通常，通过蛋白质组学技术发现的新型生物标志物的临床相关性首先使用ELISA进行评估。这是因为ELISA是一种稳健、易于使用且高成本效益的分析工具。

虽然ELISA具有足够的分析灵敏度来测量CSF中的痕量神经元蛋白，但它往往缺乏测量血液中这些蛋白的灵敏度。该方法还容易出现操作错误，而且优化适合ELISA的抗体对通常需要很长时间。

尽管ELISA广受欢迎且易于使用，但新型超灵敏免疫测定技术的发展极大地提高了分析灵敏度（见下文，Simoa和ELLA）。这些新颖创新的免疫测定技术提供了更高的灵敏度、准确性和更高效的样本测量。虽然ELISA在临床诊断中的主导地位不会急剧下降，但体外诊断行业的未来在于免疫分析的数字化和多重检测。

4. 化学发光和电化学发光（CLIA）

CLIA技术用于Lumipulse（Fujirebio）和HISCL（Sysmex）仪器。另一方面，ECL技术则用于MesoScale Discovery（Lilly Research Laboratories）和Elecsys（Roch）分析系统。在临床神经化学中，这两种技术被用于诊断AD。患者CSF中Aβ和磷酸化tau蛋白的测量通常使用Elecsys和Lumipulse平台进行，而Mesoscale Discovery在建立血浆中磷酸化tau蛋白的测量方面发挥了重要作用。Elecsys和Lumipulse平台也在开发类似的检测方法。

与ELISA等比色法相比，发光法的一大优势在于发光是对分析反应的绝对测量，而比色法测量的是酶反应的产物，是相对测量（这也与CLIA的某些方法有关）。该技术的其他优点还包括动态范围宽、高灵敏度和特异性。不过，CLIA技术也有一些局限性。包括与ELISA相比，成本较高、可用的分析物和检测组套有限，以及封闭的分析系统。

CLIA显示出用于多重免疫分析的巨大潜力，这在临床应用中越来越受欢迎。例如，多重CLIA采用阵列技术，将不同的抗原固定在固相上，这样就可以同时进行多个反应，例如Mesoscale Discovery System。预计随着这些技术的发展，新型生物标志物转化为临床应用的速度将加快。

5. Simoa

近年来，多个研究小组采用Simoa评估在CSF替代基质（例如血浆或唾液）中测量经典痴呆生物标志物的诊断潜力。在AD研究领域，CSF转化到血浆的最重要步骤包括用Simoa测量血浆中的经典生物标志物（Aβ42、Aβ40、p-tau181、p-tau217、p-tau231和总tau蛋白）以及新兴的互补生物标志物（NfL、GFAP）。除了使用Quanterix提供的试剂盒外，还在相关患者队列中建立和验证了多种自制Simoa检测方法，并且在特定病例中进行了商业化。

尽管目前Simoa产品组合主要包括仅供研究使用的检测，但由于最近推出了首个用于测量血浆p-tau181的实验室开发检测，该技术可能会进入痴呆诊断领域 (https://www.quanterix.com/press-releases/quanterix-launches-first-ptau-181-plasma-laboratory-developed-test-for-clinical-diagnostic-and-research-applications-in-the-us/)。在允许的国家，其他Simoa检测，例如血浆NfL也已通过临床使用验证。

Simoa无可争议的优势是其灵敏度，通常是传统ELISA高1000倍，这对神经退行性痴呆领域至关重要，因为许多目标蛋白以极低的浓度存在。一个明显的说明性例子是，在神经退行性生物标志物NfL的平台比较研究中，所有三个平台都使用了相同的抗体对，但仅在Simoa NfL检测中观察到健康对照和多发性硬化症患者之间的血浆水平显著差异。由于结合了数字和模拟读数，Simoa 还提供了宽动态范围。Simoa的其他优势之一是该技术提供高通量（在HD-X/HD-1上运行时，单次运行最多可获得288个数据点），这对于考虑使用平台进行大批量分析至关重要。除了各种强大的检测组套外，Simoa还支持自制检测的设计。在痴呆生物标志物开发的工作流程中，内部开发的Simoa检测可作为验证通过蛋白质组学研究发现的新候选生物标志物的工具发挥重要作用。最后，除了单重检测外，还可以进行多重检测，这样就能在单次检测且低样本量下同时测量多个感兴趣的分析物。考虑到许多神经退行性疾病（例如AD）的多因素性质，多重检测是有益的，结果表明测量标志物组合可提高诊断性能。

限制Simoa整体可用性的最主要因素是仪器以及专用耗材和试剂的高昂成本。此外，还需要专业人员来确保平台的正常运行和维护。

最近的研究报告了通过提高磁珠读取效率获得的Simoa的进一步优化。改良后的技术可以检测低至亚阿托摩尔浓度的蛋白质；这种灵敏度如果能投放市场，将为在新基质中测量生物标志物打开一扇机会之窗。

6. 微流控免疫检测（ELLA）

ELLA卡盒广泛应用于生物医学研究领域，例如神经科学、癌症、COVID-19和炎症。在神经科学生物标志物研究中，ELLA检测在CSF中验证了26种蛋白质，包括NfL、神经纤维丝重链(NfH)、壳多糖酶3样蛋白1 (CHI3L1)和GFAP。此外，大多数蛋白质（例如NfL和NfH）也可在血液中检测到。

由于ELLA平台相对较新，迄今尚未应用于神经临床实践。不过，对CSF和血液中NfL和NfH的分析运行良好。将来，这些检测可应用于ALS的诊断等方面。

ELLA平台易于使用，可快速生成结果，并产生可靠的数据。此外，它是一种小型台式设备，可以很容易地应用于诊所的日常工作。使用不同的技术验证蛋白质组学数据，例如新的候选生物标志物，是迈向神经系统疾病新生物标志物非常重要的一步。为此，ELLA开放式卡盒版本允许用户自行设置检测。这一点至关重要，因为已确定的候选生物标志物通常无法在市场上获得现成的、易于使用的、高通量的免疫检测。

在研究方面，ELLA平台的缺点是必须使用整个卡盒，而不能为连续运行保存孔。此外，每个样本的成本也比一般的ELISA更贵。在检测性能方面，ELLA检测高灵敏度，检测限低，在低皮克甚至亚皮克范围内；但在NfL和某些细胞因子方面，还达不到Simoa Bead技术的灵敏度。

未来，小巧易用的台式ELLA平台可应用于日常临床工作，分析低丰度的生物标志物，帮助临床医生诊断检查神经系统疾病。此外，将ELLA技术应用于急诊室直接的即时检测或重症监护室病人监测的床旁检测也是可行的。

7. 聚集方法（种子扩增测定）

虽然种子扩增测定（SAA）最早被成功用于检测人类朊病毒，但目前也被用于检测朊病毒样聚集体。在所有相关临床应用中，SAA被证明能有效检测突触核蛋白病。

经过多年的协调和环形对比试验评估，实时震荡诱导转化技术（RT-QuIC）现已成为一种可靠的检测方法，可用于分析CSF和嗅觉粘膜，为散发性克雅氏病（sCJD）的临床诊断提供支持。朊病毒的CSF RT-QuIC阳性已被纳入sCJD的诊断标准，而蛋白质错误折叠循环扩增仍仅限于分析变异型CJD。

SAA的主要优势是能够扩增微量原纤维（小于飞克），而目前的免疫测定方法无法检测到这些原纤维。与免疫检测相比，SAA不会与目标淀粉样蛋白的单体产生交叉反应。SAA不仅有可能增加我们对错误折叠蛋白的了解，还能帮助我们在早期诊断α-突触核蛋白病变。

尽管SAA有很多优点，但这些技术也有不足之处。目前RT-QuIC可检测的异常蛋白质数量有限。α-突触核蛋白和tau蛋白的应用缺乏标准化的方案和试剂，许多已发表的方案都很耗时（2到5天）。尽管SAA在各种生物样本中都有很高的灵敏度和特异性，但似乎不适用于血液，而血液是收集最广泛的生物样本。最后，迄今为止，SAA技术还不能定量，也不能分析渐变差异，这限制了其在治疗或疾病进展监测方面的应用。

目前，CSF和皮肤中的α-syn SAA也是鉴定突触核蛋白病的一种很有前途的工具，即使在早期阶段也是如此。为了促进α-syn SAA在PD和相关疾病诊断检查中的应用，需要提高方案的标准化和检测自动化，就像在 AD 生物标志物的方面所做的那样。目前，由于缺乏定量反应，可能无法在抗α-syn药物的临床试验中使用这些检测作为结果指标。SAA的动力学痕量荧光分析和/或样本连续稀释等方法可获得半定量反应，但仍需进一步研究。此外，与其他生物标志物（例如蛋白病的其他生物标志物或神经变性和突触功能障碍的生物标志物）以及遗传状态之间的关系和相互作用也需要进一步研究。

蛋白质组学与转录组学

尽管蛋白质组的测量更为直接，但在痴呆症领域，转录组的分析在生物标志物发现研究和治疗方面也有一些重要的应用。对于蛋白质在健康和患病个体之间的丰度差异，可能有多种原因：（1）丰度可能直接受到疾病的影响，例如蛋白质不再降解、磷酸化或聚集为聚集体；（2）疾病可能导致基因调控发生变化，从而引起蛋白质水平的变化。只有后一种情况可以通过RNA-seq进行检测。因此，同时研究蛋白质组和转录组是非常有价值的，因为多组学方法可以揭示疾病是否在基因调控或蛋白质水平上影响大脑。例如，研究表明，在sCJD患者大脑中，TREM2在mRNA和蛋白质水平上都有所增加，而ADAM10在蛋白质水平上有所增加，但在mRNA水平上没有增加。同样，这种差异也可以通过系统的方式进行探究，从而揭示驱动蛋白质组变化的生物标志物。

此外，源自大脑的几种类型细胞外RNA可通过细胞外囊泡转运至CSF和血清。因此，可以对CSF进行RNA-seq，以揭示脑源性mRNA和microRNA。通过液体活检发现了PD和AD几种不同丰度的microRNA、长链非编码 RNA和mRNA。

据我们所知，目前还没有基于RNA的生物标志物被用于痴呆症领域的诊断。不过，上述检测细胞外RNA的最新进展表明，RNA生物标志物最终可能是可行的。

虽然大多数神经退行性疾病都以异常蛋白质聚集为特征，但值得注意的是，产生蛋白质的转录组也可以作为治疗患者的靶点。通过反义寡核苷酸阻断mRNA的转录本，可以降低痴呆症病变中与淀粉样原纤维形成相关的几种蛋白质的单体浓度。在小鼠模型中，这种疗法已被证明是有效的，而针对几种疾病，目前正在进行反义寡核苷酸的（预）临床试验。反义寡核苷酸已被设计用于降低ALS和FTD模型中C9orf的表达，靶向亨廷顿氏病HTT基因中的 CAG重复序列，并阻断与FXTAS相关的FMR1基因中的CGG重复序列。

结束语

近年来，我们看到基于生物流体的神经退行性痴呆生物标志物取得了巨大发展。尽管我们需要亚洲通的生物标志物，但考虑已经取得的一些成功的根本原因可能很重要。第一个也是最明显的原因是技术的进步。另一个原因是，如今发现新型生物标志物的队列表型更为深入。最后，在靶向生物标志物发现项目中，以更详细的分子细节表征感兴趣的病理学或病理生理过程的生物标志物方面变得越来越普遍。

具有更高通量的组学工作的改进方法促进了生物标志物发现项目从所谓的“三角形”到“矩形”研究设计的范式转变。在经典的三角形设计中，通过大量的工作流程对少量选定的样本进行表征，然后使用靶向方法在亚洲通的样本中对选定的差异表达候选生物标志物进行评估。相比之下，矩形策略依赖于使用相同工作流程的多项研究，将发现转移到全人群环境中，以区分病理效应和研究特异性效应。另一个需要考虑的重要方面是，没有一种完美的生物标志物发现或验证方法；各有利弊，可以互补价值（Fig.?2）。这些方法测量的是“子组”，因此可以一起使用以提高覆盖率。生物标志物发现者可能希望将这些方法结合起来，最终形成基于网络的生物标志物工具，用于神经退行性疾病的精准医疗应用。要实现这一目标，实验室学科和子学科之间的合作，以及与临床专家和影像学专家的密切互动将是关键。

Fig.?2 Comparison of the different immunoassay platforms and mass spectrometry platforms discussed in this lexicon paper